细胞分选实验介绍

2017-08-16

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一、细胞分选服务介绍

细胞分选（Cell Sorting）是根据细胞的物理、生化及免疫学属性，将混合细胞群体分离为具有不同特性的几个亚群的方法。该技术能够在保持细胞活性的前提下，实现高纯度、高回收率的目标细胞富集，是细胞生物学研究中不可或缺的工具。

细胞分选是据细胞的属性，将混合细胞分为具有不同特性的几个不同类群的方法。细胞分选常用的方法是流式细胞分选（FACS，Fluorescence-Activated Cell Sorting）和免疫磁珠细胞分选（MACS，Magnetic-Activated Cell Sorting）。此技术广泛应用于免疫学、血液学、肿瘤学和神经生物学中。

为什么要进行细胞分选？

在大多数生物学研究中，从组织中分离出的细胞往往是异质性混合群体。为了研究特定细胞类型的功能、基因表达或信号通路，必须先将目标细胞群从混合样本中纯化出来。细胞分选正是实现这一目标的关键技术步骤。

二、实验原理

2.1 流式细胞分析原理

流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是一种用于检测单个细胞荧光信号的高灵敏度分析技术。借助特异性荧光探针，该技术能够以每秒分析数千至数万个细胞的速度，对复杂细胞群体进行多参数同步检测，为研究人员给予快速、高效的细胞分析手段。

经荧光分子标记的细胞或微粒进入流式细胞仪后，在鞘液作用下形成稳定的液流，并以恒定速度依次顺利获得检测区域。当细胞逐个经过激光聚焦点时，特定波长的激光激发荧光探针产生荧光信号。光学系统根据荧光的波长（颜色）收集并引导荧光至相应检测器，检测器将荧光信号转换为电信号，经放大和数字化处理后，由电子系统进行分析并传输至计算机。最终，细胞的各项检测信息被实时记录，并以图形化方式显示在计算机屏幕上。

2.2 流式细胞分选原理

流式细胞分选（Fluorescence-Activated Cell Sorting，FACS）是指对目标细胞进行物理分离和富集的技术。流式细胞分选通常在完成常规流式检测后立即进行。

在分选过程中，液流在特定频率下受到精确控制的振动，稳定地断裂形成均一液滴。包含目标细胞的液滴根据预先设定的分选条件被识别，并分别赋予不同极性和强度的电荷。随后，这些带电液滴顺利获得恒定电场时发生偏转，按照设定轨迹进入指定的收集容器（如离心管或多孔板）；而未带电、含非目标细胞的液滴则流入废液收集系统，从而实现目标细胞的高效分离与富集。

流式细胞分选是利用流式细胞分选仪，对细胞的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测，它可根据发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分开并可实现单克隆分选，对复杂样本中的细胞进行鉴定、分类、定量和分离。

2.3 免疫磁珠分选原理

免疫磁珠细胞分选是把细胞用超级顺磁性的 MACS MicroBeads （MACS微型磁珠）特异性地标记，磁性标记完后，把这些细胞顺利获得一个放在强而稳定磁场中的分选柱。分选柱里的基质造成一个高梯度磁场。被磁性标记的细胞滞留在柱里而未被标记的细胞则流出。当分选柱移出磁场后，滞留柱内的磁性标记细胞就可以被洗脱出来，这样就完全可以取得标记和未标记的两个细胞组份。

三、实验流程

3.1 流式细胞分选操作步骤

1. 取1×10^5个待检测的细胞，加5 ml DPBS洗涤，室温2000 r/min离心5 min，弃上清，然后用200 μl 0.5% BSA-DPBS重悬细胞；

2. 向细胞悬液中加入荧光染料标记的抗体，4℃孵育30 min；

3. 将染好的细胞用0.5% BSA-DPBS 洗涤两次，然后用500 μl 0.5% BSA-DPBS重悬，流式细胞仪检测；

4. 结果统计分析。

3.2 免疫磁珠分选操作步骤

1. 离心收集待分离细胞，用少量PBE孵育液（0.5%BSA、0.08%EDTA，PH7.2），真空抽滤除菌及液体内气体，充分混悬细胞（0.5 ml/1×10^8细胞），加入一抗（10-20 μg/ml终浓度），4℃孵育30 min；

2. 用20倍体积PBE洗细胞一次，再加PBE（0.3 ml/1×10^8细胞）充分混悬细胞后，加入相应二抗包被的超微磁珠，混匀后置8~15℃孵育10~15 min；

3. 将分离柱安装入磁场中，加入0.5 ml PBE，在重力作用下自然流尽,以预处理分离柱。

细胞分选

什么时候适合使用流式细胞分选？

在以下情况下，建议采用流式细胞分选技术：

需要取得高纯度目标细胞群体时，可实现 95%～100% 的细胞纯度。
需要依据多个检测参数同时筛选目标细胞时，可根据多参数分析结果进行精准分选。
需要分离细胞表面低表达抗原的细胞群体时，可实现高灵敏度识别与分选。
需要依据特定细胞标志物的精确定量表达水平进行细胞分离时，可按照标志物表达密度进行精准分选。
在多孔培养板中单颗分离单细胞
需要依据细胞内成分或功能性荧光染色结果进行分选时，例如根据荧光底物水解产物或其他功能性荧光信号对细胞进行分离。
需要从混合细胞群中检测并分选极低丰度细胞时，可分选频率低至 0.001% 或更低的稀有细胞群体。